摘要
在这项研究中，作者发现γ-H2AX（DNA双链断裂（DSBs）的标志物）和活化形式的磷酸化Chk2（p-Chk2）的水平在与HBV相关的肝细胞癌和邻近的再生结节中均显著升高。同样，将pHBV或pMyc-HBx质粒导入细胞会诱导γ-H2AX灶的积累并增加p-Chk2水平。在这些细胞中，Cdc25C磷酸酶（Ser（））和CDK1（Tyr（15））的抑制性磷酸化水平升高。因此，细胞周期进程在G2/M期被延迟。这一现象提示HBVX蛋白（HBx）激活ATM-Chk2途径可诱导细胞周期延迟。因此，用咖啡因或siRNA对共济失调毛细血管扩张突变基因（ATM）的抑制可消除了p-Chk2水平的增加，并恢复ChangX细胞中延迟的CDK1激酶活性。作者还发现，细胞质HBx而非核HBx诱导了活性氧（ROS）的产生，并导致γ-H2AX灶的积累和p-Chk2水平的升高。总之，这些数据表明HBx诱导的ROS积累导致DNA损伤，从而激活ATM-Chk2途径。作者的发现为HBV发病机理提供了新见解。
DNADSB发生在HBV
相关的肝细胞癌和再生结节中
DNA的双链断裂（DSB）是遗传不稳定性的主要原因。H2AX和Chk2都可由DSB诱导。在这项研究中，作者对HBV感染癌症患者石蜡包埋的HCC组织和邻近再生结节的标本用抗-γ-H2AX和抗-p-Chk2抗体进行了免疫组织化学检测，以评估两者的水平。结果显示，在十个正常肝脏组织中未观察到核染色阳性，但有40-60％的HCC患者的再生结节和肿瘤组织呈γ-H2AX和p-Chk2染色阳性（图1a，b），且随着疾病的进展，γ-H2AX和p-Chk2阳性细胞的比例增加（图1c）。这一结果提示，在乙肝病*感染的肝组织中DSB的形成是持续进行的（注：作者并未对炎症存在进行鉴定，无从知道炎症轻微的免疫耐受期是否存在DSB）。
图1.在HBV相关的肝细胞癌中DNA损伤信号增加。
HBx在细胞中的表达
增加了γ-H2AX阳性细胞的比例
HBx在HCC的发病机理中起着至关重要的作用。为明确肝组织中γ-H2AX的积累与HBx直接相关，作者首先对可诱导表达HBx蛋白的ChangX细胞进行γ-H2AX染色。这些细胞在连续传代过程中，撤DOX可检测到HBx蛋白。作者发现所检查的细胞中有一半γ-H2AX呈强阳性（图2a）。接下来，将HBx基因瞬时导入到Chang细胞中，发现48h后，有24.7％的HBx转染细胞出现代表DNA损伤的γ-H2AX阳性灶。接下来，作者在pHBV转染的细胞中证实了上述发现。将HBV基因组质粒（pHBV）转染到Chang细胞中，48小时后γ-H2AX染色的结果提示，在大约20％pHBV转染的细胞中发生了DNA损伤（图2b）。然而，当用HBx缺陷的HBV基因组转染细胞（PHBV-X-;HBx蛋白的翻译起始密码子被破坏），γ-H2AX阳性细胞的比例显著降低（22.6％对11.7％，**P0.01）。作者通过免疫印迹检测γ-H2AX的水平，证实了这些发现，表明pHBV以剂量依赖的方式提高了γ-H2AX的水平（图2c）。但是，即使没有HBx表达，仍然有γ-H2AX阳性细胞保留（图2b，c）。因此，在pHBV-X-?细胞中γ-H2AX阳性细胞可能来自HBV表面抗原（HBs）表达，因为最近报道HBs也可以诱导DNA损伤。总之，这些数据表明HBx是引起HBV相关肝细胞DSB的主要因素之一。
图2.HBx表达后，γ-H2AX阳性细胞增加。
HBx激活ATM–Chk2途径
会导致G2/M过渡期细胞周期延迟
ATM和ATR是响应不同类型DNA损伤的主要传感器激酶。它们激活Chk1和Chk2，磷酸化下游分子p53和Cdc25家族蛋白等。因为在表达HBx的细胞和人类肝脏组织中，代表DSB的γ-H2AX的水平增加，所以作者研究了HBx是否激活ATM–Chk2信号级联反应。众所周知，在DNA受损时，ATM会使Chk2的Thr68磷酸化，而ATR在停滞的复制叉处使Chk1的Ser磷酸化（Bartek＆Lukas，）。HBx表达48小时后p-Chk2水平升高，而p-Chk1水平保持不变（图3a）。为了验证这一过程中ATM是否为p-Chk2的上游激酶，作者将ATM或ATR的siRNA与HBx共转染。如图3b所示，HBX诱导的p-Chk2水平的升高被ATMsiRNA消除，但未被ATRsiRNA消除，这表明HBx诱导的p-Chk2水平升高是由ATM激活的。
此外，作者研究了HBx对ATM-Chk2途径的激活是否影响细胞周期进程。在G2/M转换时，CDK1蛋白Tyr15的去磷酸化激活其激酶活性，该反应由Cdc25C磷酸酶催化。DNA受损后，活化的Chk2使Cdc25C的Ser磷酸化，失去对CDK1的Tyr15去除磷酸的能力，从而抑制细胞周期进程。作者发现，表达HBx的细胞中Cdc25C（Ser）被磷酸化，表现为p-Cdc25C水平与p-Chk2水平一起增加（图3a）。此外，在HBx转染的细胞中CDK1的p-Tyr15水平仍然是升高的（即未被激活）（图3c，右图）。总之，这些数据表明，HBx激活ATM-Chk2途径会影响细胞周期进程。
作者进而用pMyc或pMyc-HBx转染了Chang细胞，并使用双胸苷阻断（DTB）方法将其同步在G1/S交界处。从DTB释放的时间定义为零时间（T?=0）。FACS分析结果（图3c）显示，从DTB释放8小时后，对照组和HBx转染组中的大多数细胞已进入G2/M期（83.99％vs78.78％）。12小时后，对照组中G2/M期的细胞百分比已显著降低（降至22.61％），但在HBx转染的细胞中仍保持较高水平（52.1％）。与之一致，ChangX细胞中CDK1活性在DTB释放后12小时达到峰值，相对于Chang细胞延迟了2小时。在ChangX细胞中，CDK2活性的恢复也被延迟。与CDK1和CDK2激酶活性一样，ChangX细胞中细胞周期蛋白A和B的降解被延迟（图3d）。作者推测，如果由HBx引起的细胞周期延迟是由ATM–Chk2途径引起的，则咖啡因对ATM的抑制作用将挽救这种细胞周期进程的延迟。作者发现ChangX细胞中CDK1激酶活性在DTB释放后12小时达到峰值，而添加咖啡因（作为ATM抑制剂）导致该峰更早地出现在9小时（图3e）。因为曾有报道HBx可诱导p38活化，而活化的p38激酶参与了DNA损伤反应。作者也设计了一组p38MAPK抑制剂SB的实验。与加入咖啡因组相比，添加SB不会改变ChangX细胞的细胞周期概况。综上所述，这些数据表明HBx激活了ATM-Chk2信号级联反应，从而导致了G2/M期的细胞周期延迟。
图3.HBx通过ATM-Chk2途径激活诱导G2/M延迟。
HBx增加细胞ROS水平，
这与DNA损伤反应的激活有关
接下来，作者研究了肝细胞中HBx蛋白诱导DNA损伤的机制。作者观察到，将pMyc-HBx转染到Chang细胞中会以时间依赖性方式增加细胞ROS的水平（图4a，左）。此外，ROS水平的升高伴随着p-Chk2水平的升高（图4a，右）。既往研究报导，HBx定位于细胞核、细胞质还是线粒体中取决于其表达水平，其亚细胞定位对其在致癌作用各个阶段的多效性作用很重要。因此，作者使用了HBx的两个不同亚细胞定位的突变体pHBx-NLS和pHBx-NES，它们分别编码在N末端包含核定位信号（NLS）或核输出信号（NES）的HBx。正如预期的那样，HBx-NLS仅位于细胞核中，而HBx-NES主要位于细胞质中（图4c）。值得注意的是，有24％的pHBx-NES转染的细胞中γ-H2AX免疫染色阳性。相比之下，只有8.5％的转染了pHBx-NLS转染的细胞γ-H2AX免疫染色呈阳性（图4c）。与此一致，pHBx-NES转染的细胞中p-Chk2水平高于用pHBx-NLS转染的细胞（图4c）。
图4.HBx诱导的DNA损伤与ROS的产生相关。
讨论
这项研究中，作者证明了HBx引起宿主基因组的双链断裂。为了应对这些DSB，宿主细胞通过激活ATM-Chk2检查点途径，从而延迟了细胞周期进程。此外，细胞质HBx(HBx-NES)可以诱导ROS和γ-H2AX灶的形成，而核HBx(HBx-NLS)则不能。因此，线粒体产生的ROS可能是肝细胞HBV相关DNA断裂的主要来源。
KimS,LeeHS,JiJH,ChoMY,YooYS,ParkYY,ChaHJ,LeeY,KimY,ChoH.HepatitisBvirusXproteinactivatestheATM-Chk2pathwayanddelayscellcycleprogression.JGenVirol.Aug;96(8):-.doi:10./vir.0..EpubApr14.PMID:.
文字：彭思雯
排版：阿卜杜
校对：李桂馨、郑立威
片警实验室
乙肝病*病原学及相关研究
pianjinglab
.
