摘要
树突状细胞(Dendriticcells，DCs)是一种抗原递呈细胞，在宿主免疫应答中起着重要作用。本研究对64例慢乙肝患者和19例健康对照者外周血单核细胞进行分析，通过流式细胞术分离浆细胞样DCs(pDCs)和髓样DCs(mDCs)，分析了慢乙肝患者的DCs功能变化，并鉴定了与DCs功能相关的基因。结果显示，健康对照者外周血DCs数量与慢乙肝患者无显著性差异。但在功能上，慢乙肝患者的DCs在抗原递呈能力、迁移能力和细胞因子产生能力等方面显著下降。干扰素-γ酶联免疫斑点试验的结果提示，pDCs表面标记蛋白的表达水平与HBV特异性T细胞反应有关。应用RNA-seq技术进一步分析DCs基因的表达情况发现，患者免疫相关基因表达水平显著降低，其中IL6ST表达水平与DCs表面标志物表达水平呈正相关。调节树突状细胞IL6ST的表达水平可恢复树突状细胞的功能。据此作者认为，IL6ST的表达下调是慢乙肝患者DCs功能受损的原因之一。调节IL-6家族细胞因子信号可能有助于HBV感染后DCs功能的恢复。
树突状细胞简介
年，Steinman与其导师Cohn在小鼠的脾脏发现具有树枝状突起的独特形态的细胞，并将之命名为树突状细胞(dendriticcell,DCs)。树突状细胞尽管仅是免疫细胞中很小的一群，却是目前所知抗原递呈能力最强的抗原递呈细胞(antigenpresentingcell,APC)。它最大的特点是能够刺激初始型T细胞的活化和增殖，而巨噬细胞和B细胞等仅能刺激已活化的T细胞或记忆性T细胞。因此，DCs是适应性免疫应答的启动子，与免疫激活和免疫耐受密切相关。体内的DCs均起源于多能造血干细胞，目前主要有两条公认的发育途径：与吞噬细胞相同的髓系起源及与淋巴细胞相同的淋巴细胞系起源。功能上，髓样DCs(myeloidDCs,mDCs)主要专职递呈抗原，活化抗原特异性的CD4?T细胞、CD8?T细胞、B细胞及自然杀伤细胞。而浆细胞样DCs(plasmacytoidDCs,pDCs)和mDCs有着非常大的区别，作为体内I型干扰素的主要产生细胞，pDCs主要参与抗感染免疫；此外，它也具有一定的抗原呈递能力。
年Steinman首次在JEM杂志上报道树突状细胞的形态。DCs数量与细胞表面标志物表达水平
作者分析了19名健康受试者和51名接受核苷类似物（NA）治疗的慢乙肝患者DCs的数量和表面标志物。健康受试者和慢乙肝患者之间的DCs数量没有显著差异(图1A)。作者设计合成了89个HLA-A*限制性细胞*性T淋巴细胞HBV特异性表位，加上4个先前报道的表位，共用93个特异性表位多肽对51例患者中37例HLA-A24阳性者的外周血单核细胞进行刺激，IFN-γ酶联免疫斑点(ELIspot)检测T细胞活性。根据ELIspot结果将37例乙肝患者分为有HBV特异性T细胞应答的(17例)和无应答的(20例)两组，比较两组间pDCs和mDCs的数量和表面标志物的水平。有HBV特异性T细胞应答组和无应答组患者的pDCs和mDCs数量均无显著差异(图1B)；但在分析表面标记物时发现，应答组的pDCs表面标记物(CD80、CD83、CD40和CCR7)的表达水平显著高于无应答组，而mDCs中两组之间无显著差异(图1C)。
图1DCs数量及表面标记物的表达水平。(A)健康对照组和乙肝患者DCs的数量。(B)HBV特异性T细胞反应及DCs数量分析，白柱和黑柱分别表示T细胞反应为非阳性和阳性的患者组。(C)HBV特异性T细胞反应及DCs表面标记物表达分析。
不同病理条件下DCs功能的比较
在DCs诱导特异性免疫应答的过程中，DCs的重要功能包括吞噬、迁移、产生细胞因子以及递呈抗原。作者以混合白细胞反应（mixedleukocytereaction，MLR）检测来评估T细胞增殖能力、以迁移到含趋化因子培养基的DCs数量来反映迁移能力、以吞噬乳胶珠/兔源IgG-藻红蛋白复合物的DCs数目测定吞噬能力、测定DCs产生的IFN-β来反映细胞因子生产能力，比较了12例健康对照者和10例接受NA治疗的慢乙肝患者的DCs功能。前面提到，HBV感染引起的表面标志物表达的差异仅见于pDCs，因此，作者仅进行了pDCs的功能比较。结果显示，乙肝患者的抗原递呈能力(图2A)、迁移能力(图2B)、吞噬能力(图2C)以及细胞因子生产能力(图2D)均低于健康对照者，特别是抗原递呈、迁移和细胞因子生产能力显著降低。
图2健康对照组与乙肝患者pDCs。(A)抗原递呈能力；(B)迁移能力；(C)吞噬能力；(D)细胞因子产生能力的比较。
不同病理状态下DCs基因表达
为了确定HBV感染中导致pDCs功能减退的相关基因，作者对以下四组队列的pDCs做了RNA-seq分析：健康对照者(7例)、肝功能正常的HBV携带者(7例)、未经治疗的慢乙肝患者(6例)以及接受NA治疗的慢乙肝患者(12例)。基因表达谱分析主要分为两组，第一组为健康人和肝功能正常的乙肝病*携带者，第二组为未经治疗或接受NA治疗的慢乙肝患者。在四组表达水平差异显著(P0.05)的个基因中，作者选择了个在健康对照组和肝功能正常的CH患者中表达水平较高，但在HBV携带者中低表达的基因，作为可能影响DCs功能的候选基因。生信分析提示，其中30个基因的功能与免疫系统相关(图3)。
图3不同病理条件下pDCs的RNA组学分析，如图列出了30个与免疫系统相关的基因。
作者进而在这些免疫相关基因中鉴定出六个可能导致pDCs功能下降的潜在基因，它们是白介素-6信号转换子(interleukin-6signaltransducer，IL6ST)，细胞因子信号转导抑制因子3(suppressorofcytokinesignaling3，SOCS3)，信号转导素4A(semaphorin4A，SEMA4A)，含TIR结构域的适配子(TIRdomaincontainingadaptorprotein，TIRAP)，核因子kappaB激酶亚单位β抑制剂(inhibitorofnuclearfactorkappaBkinasesubunitbeta，IKBKB)和干扰素调节因子5(interferonregulatoryfactor5，IRF5)。这些基因的共同特点是，在健康者和肝功能正常的HBV携带者中高表达，在未治疗的慢乙肝患者中表达水平大大降低，在接受NA治疗的慢乙肝患者中表达水平稍有提高。接着，作者在12例慢乙肝患者中分析了这6个基因的表达水平与DCs表面标记物的相关性，发现只有IL6ST与DCs表面标记呈显著正相关(图4)。
图4IL6ST基因表达水平与DCs表面标志物表达水平呈正相关。
IL6ST表达水平对DCs功能的影响
IL6ST基因编码的CD是IL-6、OSM等多个细胞因子的共同信号转导子，在多个组织细胞表面有广泛表达。为了研究DCs功能随IL6ST表达水平的变化，作者分离制备了10例接受NA治疗的慢乙肝患者和12例健康对照者的pDCs，并对其进行外源IL6ST的过表达或内源IL6ST表达的敲低。结果发现，在接受NA治疗的慢乙肝患者和健康组中，IL6ST过表达组与对照组相比具有更高的抗原递呈能力(图5A)，而敲低IL6ST表达组的抗原递呈能力显著降低(图5B)。在细胞迁移能力(图5C，D)和产生细胞因子(图5E，F)的能力方面，也呈现出与抗原递呈能力相同的变化趋势。
图5IL6ST对DCs功能的调控。(A，B)IL6ST表达水平对DCs抗原递呈能力的影响。(C，D)IL6ST表达水平对DCs迁移能力的影响。(E，F)IL6ST表达水平对DCs细胞因子生产能力的影响。
同样，用OSM处理后，健康对照组和慢乙肝患者的pDCs抗原递呈能力和迁移能力均显著增强(图6)。而过表达IL6ST可以进一步增强OSM提高pDCs抗原递呈能力和迁移能力的效果(图7A，C)，敲减IL6ST的表达则会使OSM对pDCs抗原递呈能力和迁移能力的增强效果消失(图7B，D)。
图6肿瘤抑制素M处理对DCs功能的影响。(A)OSM处理对健康组和接受NA治疗的慢乙肝患者的抗原递呈能力均有显著提高。(B)OSM处理可显著提高健康组和接受NA治疗的慢乙肝患者的迁移能力。
图7不同IL6ST表达水平下，肿瘤抑制素M对DCs功能的影响。(A)在pLVSIN-lentivirus的过表达系统中，OSM对DCs抗原递呈能力的影响。(B)在shRNA-lentivirus敲低系统中，OSM对DCs抗原递呈能力的影响。(C)在pLVSIN-lentivirus的过表达系统中，OSM对DCs迁移能力的影响。(D)在shRNA-lentivirus敲低系统中，OSM对DCs迁移能力的影响。
总结
简而言之，本研究发现，慢性乙型肝炎患者浆细胞来源的pDCs细胞内IL6ST的表达受到抑制，导致迁移、抗原呈递和细胞因子产生能力受损。IL6ST表达抑制可能是患者DCs功能受损的原因之一。因此，通过调节IL-6家族细胞因子信号转导恢复pDCs的功能可能是有效的HBV治疗策略，具有重要的临床意义。
但本研究也存在一定的局限。例如，作者只检测了外周血，但没有检查肝组织的免疫反应，而探究HBV感染对肝组织驻留DCs的影响以及IL6ST与肝组织DCs的关系也具有重要的意义。此外，本研究的临床队列中健康对照组的平均年龄为33岁，而慢乙肝患者为57岁，因此不能排除健康对照组与HBV感染患者的年龄差异对于DCs功能差异的影响。
文献来源：
YonejimaA,MizukoshiE,TamaiT,etal.CharacteristicsofimpaireddendriticcellfunctioninpatientswithhepatitisBvirusinfection[J].Hepatology,,70(1):25-39.
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