摘要
在感染HBV的肝细胞内，开链松弛环状的DNA（rcDNA）被修复成共价闭合环状DNA（cccDNA），并与组蛋白和非组蛋白一起以微型染色体的形式存在于细胞核内。近年来，许多团队对cccDNA相关组蛋白翻译后修饰所介导的HBV转录调控进行了研究。该文使用基于线性HBV基因组单体分子转染的体外HBV复制模型系统，研究了组蛋白变体H3.3在这方面的作用。结果发现，在细胞中异位表达的组蛋白变体H3.3参与了将病*cccDNA组装成微小染色体的过程，并与活性组蛋白标记H3K4me3（组蛋白H3上4位的赖氨酸三甲基化）和HBV转录水平的升高相关；降低H3.3的水平时则结果相反。此外还发现，H3.3组装到cccDNA中需要组蛋白伴侣HIRA。HIRA水平降低会导致HBV中间体减少。这些结果表明，组蛋白变体H3.3正向调节HBV转录。病*染色质动力学的表征有助于发现新的治疗靶标，以开发用于治疗慢乙肝患者的药物。
尽管存在有效的疫苗，但HBV感染仍然是严重的全球健康问题。HBV是一种小型的包膜DNA病*，其基因组是3.2kb的部分双链环状DNA分子。感染肝细胞后，进入细胞核的病*基因组被修复生成共价闭合环状DNA（cccDNA）分子，并充当病*转录的模板。cccDNA以与组蛋白和非组蛋白组织成微型染色体的形式存在，故其转录取决于细胞的转录机制。近年来，已有许多研究对cccDNA相关组蛋白的翻译后修饰如何调节病*转录进行了描述。组蛋白变体和染色质的结合是调节染色质功能的一种方法。组蛋白变体是相对于常规组蛋白而言的，为特殊状态的染色体所需的组蛋白。H3.3是组蛋白H3的最常见变体，它在整个细胞周期中均表达，并且其组装至染色体的过程独立于DNA复制，在转录、基因组稳定性和有丝分裂等过程中发挥重要作用。该文研究了H3.3在HBV转录中的功能，发现H3.3被组蛋白伴侣HIRA组装到cccDNA中，并且该组装与活性标记H3K4me的水平增加和HBV转录的激活相关。
1.组蛋白变体H3.3与cccDNA结合并激活HBV转录
利用Huh-7细胞系，作者首先探索了H3.3对HBV转录的作用。由于没有合适的抗体区分H3.1和H3.3，作者构建了带Flag标签的H3.3外源过表达载体（图1A）。如图1B所示，Flag抗体可以检测到H3.3。Flag-ChIP（染色质免疫沉淀）分析结果显示，变体H3.3可与病*的三个启动子（核心启动子，PreS和HBx启动子）结合（图1C）。接着作者们探究了H3.3与cccDNA的结合对病*cccDNA转录状态的影响。通过ChIP分析发现与对照组细胞相比，过表达H3.3-Flag时H3K4me3在病*核心启动子区富集（图1D），而内源组蛋白H3在核心启动子上的水平降低（图1D，左），这与活跃转录的基因启动子区无核小体的事实一致。此外，H3.3-Flag过表达后胞内病*中间体显著增加（图1E），细胞周期无变化（图1F）。这些结果表明组蛋白H3.3与HBVcccDNA结合并激活HBV转录。
图1.组蛋白变体H3.3与cccDNA结合并激活HBV转录。
（A）H3.3-Flag表达和HBV病*中间体检测方案示意图。（B）蛋白质印迹分析H3.3-Flag的表达。（C）通过ChIP分析测定H3.3与病*启动子的结合。（D）使用特异性抗体：H3（左）和H3K4me3（右）通过ChIP分析确定组蛋白H3的共价翻译后修饰。（E）转染H3.3-Flag质粒72小时后，测定HBV中间体：细胞质病*核心颗粒（cytDNA，右）和cccDNA（左）。（F）Huh7细胞过表达H3.3-Flag后的细胞周期图。
2.组蛋白变体H3.3是调节HBV转录所必需的
针对H3.3的shRNA（shH3.3）降低了H3.3编码基因（H3F3A和H3F3B）的mRNA表达（图2B）。用shH3.3处理Huh7细胞后细胞周期没有变化（图2C），病*核心启动子区H3K4me3水平显著降低，同时H3的量显著增加（图2D）。与此一致，H3.3敲低后病*的两种中间体均显著减少（图2E），病*表面抗原（HBsAg）水平也降低（图2F）。这些结果表明H3.3能通过与cccDNA结合并使cccDNA染色质处于激活状态来正向调节HBV转录。
图2.组蛋白变体H3.3是调节HBV转录所必需的。
（A）H3.3敲减实验和HBV病*中间体检测示意图。（B）实时定量PCR检测shControl或shH3.3处理的Huh7细胞样品mRNA水平。（C）shH3.3处理的Huh7细胞的细胞周期图。（D）使用特异性抗体：H3（左）和H3K4me3（右），通过ChIP分析确定组蛋白H3的共价翻译后修饰。使用核心启动子的特异性引物通过qPCR定量免疫沉淀的DNA。（E）转染shH3.3质粒72小时后，测定HBV中间体：细胞质病*核心颗粒（cytDNA，右）和cccDNA（左）。（F）ELISA测定转染细胞上清中病*抗原HBsAg水平。
3.组蛋白伴侣HIRA参与H3.3组装成HBVcccDNA
已报道有两个组蛋白伴侣协助H3.3组装到细胞染色质上：HIRA和Daxx/ATRX。由于HIRA参与将H3.3组装到DNA的常染色体区，为了探究组蛋白变体H3.3与HBVcccDNA结合的分子机制，作者们重点研究了组蛋白伴侣HIRA。利用siRNA将其敲减后（图3A和B），与病*核心启动子结合的H3.3-Flag量减少（图3C），表明HIRA参与H3.3组装到病*cccDNA的过程。siHIRA后细胞周期没有改变（图3D）。HIRA敲低后24或72小时，病*的两种中间体均显著减少（图3E和F）。综上，组蛋白伴侣HIRA将H3.3组装到HBVcccDNA，这有助于建立转录活跃的cccDNA染色质状态。
图3.组蛋白伴侣HIRA将H3.3组装到HBVcccDNA。
（A）HIRA敲减和HBV病*中间体检测示意图。（B）shControl或shH3.3处理的Huh7细胞样品mRNA水平（左）和蛋白水平（右）。（C）siControl和siHIRA条件下ChIP检测H3.3与病*启动子的结合。使用核心启动子的特异性引物通过qPCR定量免疫沉淀的DNA。（D）siHIRA处理的Huh7细胞的细胞周期图。（E-F）转染siHIRA后24（E）和72（F）小时测定HBV中间体：细胞质病*核心颗粒（cytDNA，右）和cccDNA（左）。
总结
cccDNA是HBV建立长期和稳定感染的分子来源。鉴于目前对于HBV慢性感染患者的治愈率低下，因此表征HBV调节转录的分子机制对于寻找新的治疗靶标是非常重要的。该研究表明，除了组蛋白翻译后修饰和DNA甲基化外，组蛋白变体，尤其是组蛋白H3.3，有助于体外调控HBVcccDNA的功能状态。
考虑到在病*染色质动力学中起作用的染色质调节剂的表征可能揭示新的治疗靶标，未来需要进一步的研究来确认这些分子在体内模型中的功能，以及HBV染色质动力学变化的持续时间，以开发用于治疗慢乙肝患者的药物。
文献来源：
Alvarez-AstudilloF,GarridoD,Varas-GodoyM,GutiérrezJL,VillanuevaRA,LoyolaA.ThehistonevariantH3.3regulatesthetranscriptionofthehepatitisBvirus[publishedonlineaheadofprint,Sep29].AnnHepatol.;S-(20)-9.doi:10./j.aohep..09.
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