片警微述评
很高兴看到海涛教授和孙剑教授等团队的这篇合作研究论文发表，该研究设计全面、系统，把我们和其他实验室在早期探索中碎片化的研究发现拼成了一幅panorama,并有了一些新的发现。这项研究有助于我们更为全面了解HBVRNA病*样颗粒的生物发生过程和更好地理解其作为新的病*指标的临床意义。
在我们既往的有关HBVRNA病*样颗粒的研究中，一个萦绕于心的千千结就是如何去证实或证伪该“HBVRNA病*样颗粒”的感染性。尽管-年我们实验室的师生们不断地进行各种思考与尝试，但正如该文作者在文中所述，“由于HBVRNA病*样颗粒与DNA病*颗粒具有相似的蛋白质组成和密度，因此RNA病*样颗粒的纯化在技术上具有挑战性”。技术上的困难使我们最终未能通过证实HBVRNA病*样颗粒的感染性来挑战教科书中有关构成病*基因组的核酸仅有一种，要么是DNA、要么是RNA的论断。海涛教授实验室非常巧妙地利用了L-FMAU以非竞争性的、可逆的方式阻断HBVP蛋白逆转录启动和延伸DNA、使得收集到的HBVRNA病*样颗粒具有可逆复制能力。然而，该研究的结果却是“即使在高MOI下，L-FMAU处理的RNA病*仍然不能感染HepG2-NTCP细胞”。
但是，这一结果并不能使我放弃HBVRNA病*样颗粒可能具有感染性的猜测。原文讨论中提到的HepG2-NTCP细胞感染体系对病*感染的敏感性问题，我有理由相信这个感染低效问题正是无法排除HBVRNA病*样颗粒具有感染可能性的原因所在。
考虑到作为逆转录模板的pgRNA自身即具有翻译构成核衣壳的core蛋白、逆转录和DNA聚合酶及RNaseH酶活性的P蛋白，这就意味着单枪匹马的pgRNA就已具有了合成子代病*rcDNA的全套潜能。当我们定义“HBVRNA病*样颗粒”内的核酸为“在核衣壳内的未启动逆转录或未完成逆转录过程的pgRNA及其剪接变异体”的时候，前半句已经给HBVRNA病*样颗粒的感染性留下来足够的想象空间。期待未来能有更加smart的guy，能够设计出更加有说服力的实验，来证实或证伪HBVRNA病*样颗粒的感染性。
乙型肝炎病*（HBV）是一种带有包膜的DNA病*，它通过中间产物pgRNA的逆转录进行DNA基因组的复制。值得注意的是，在慢性乙型肝炎（CHB）患者血清中可检测到HBVRNA，并可作为反映患者在治疗过程中肝内共价闭合环状DNA（cccDNA）活性的生物标志物。然而，血清中的这些HBVRNA的生物发生和分子特征仍有待进一步研究。
HBV病*颗粒包含一个3.2kb的部分双链松弛环状DNA（rcDNA）作为病*的基因组。当病*通过肝细胞特异性受体NTCP感染肝细胞后，病*rcDNA被转运到细胞核内，形成一个以微小染色体形式存在的游离于人染色体之外的cccDNA。cccDNA可以利用宿主的RNA聚合酶II进行转录，形成5种具有相同3’末端的mRNA，分别是3.5kb长的preC-RNA和pgRNA，2.4/2.1kb长的编码表面抗原的mRNA以及0.7kb长的编码X蛋白的mRNA。HBV通过蛋白启动的pgRNA逆转录过程，在病*聚合酶的催化下，在细胞质核衣壳内复制其DNA基因组。新合成的含核衣壳的rcDNA被病*表面蛋白包裹，通过细胞多囊体（MVB）分泌途径分泌至胞外，产生子代病*。除了含有DNA的病*颗粒外，内质网（ER）内腔中自组装的非核衣壳形式的亚病*颗粒通过固有分泌途径分泌出来，在细胞外以HBsAg形式积聚。此外，细胞外还可检测到大量无基因组的空病*颗粒和未被包膜包被的裸衣壳颗粒。
除了空病*颗粒外，一直以来的观点都认为只有成熟的、含有HBVdsDNA的核衣壳才能被包裹而分泌。有趣的是，早在二十多年前，人们就在CHB患者的血液中检测到了HBVRNA。最近有一项研究报道，患者血清或细胞培养上清中的HBVRNA是病*颗粒中包裹的pgRNA，但并未排除来自裸衣壳的干扰。另一项研究表明，细胞外HBVRNA虽然主要与裸衣壳相关，但也存在于衣壳免疫复合物和患者血清中的病*颗粒中。因此，血清中HBVRNA的物理存在（形式）尚待确定。
目前，核苷（酸）类似物（NAs）被用于CHB的治疗，它可以抑制HBV复制并很快使血清HBVDNA水平降低到检测下限以下，从而改善长期预后并降低肝癌发生风险。然而，由于NAs对cccDNA缺乏直接抗病*作用，HBV感染不能被完全消除。由于NAs对cccDNA的转录活性没有或几乎没有影响，在NAs治疗下，即使HBVDNA水平无法检测，HBVRNA仍会不断产生。因此，HBVRNA，尤其是pgRNA，可能成为监测CHB患者cccDNA活性的一个潜在的新型标记物。最近的研究表明，血清HBVRNA水平与患者对聚乙二醇干扰素（peg-IFN）或NAs的反应相关，可能用于指导NAs治疗的停药。然而，血清HBVRNA的性质仍不清楚。据报道，在HBV感染细胞培养上清和CHB患者血清中的细胞外HBVRNA含有pgRNA和剪接变异体。另一项研究表明，血清HBVRNA的长度不均匀，除全长的pgRNA外，还存在3’末端截短了几百个核苷酸的形式。因此，需要对血清HBVRNA的分子特征进行全面的界定，并建立一种标准化的检测方法。此外，如果pgRNA能够被包裹，那么了解HBVRNA病*颗粒如何从肝细胞中释放出来以及是否具有传染性有重要意义。
该篇文章报道了细胞培养上清和患者血清中存在含有HBVpgRNA的病*样颗粒（viron-like-particle，VLP），它们在细胞内通过pgRNA衣壳化和覆盖外包膜进行组装，并通过MVB分泌途径分泌。病*颗粒中的HBVRNA主要是剪接的pgRNA，并缺乏3’端序列。此外，作者发现HBVRNA病*颗粒不能在细胞培养中引发新一轮的感染。
HBVRNA病*样颗粒（HBVRNA-VLP）在培养细胞中存在的证据
既往研究中对血清HBVRNA存在于病*样颗粒中的证据均来自免疫共沉淀和RT-PCR实验，在经典的颗粒凝胶电泳分析中没有被确凿地证明。为此，作者采用pCMVHBV-Y63D重组病*表达质粒，该突变型HBV的P蛋白在其TP（terminalprotein）结构域存在Y63D突变。TP结构域为P蛋白发挥RNA结合功能结构，Y63D突变型P蛋白不能介导逆转录引物的合成和逆转录过程，但仍能介导pgRNA的衣壳化，因此pCMVHBV-Y63D质粒不能合成病*DNA。转染wt型和Y63D型HBV病*表达质粒后，检测细胞内病*颗粒形式，仅有wt型HBV存在衣壳化病*DNA（图1A）。非变性凝胶电泳表明在Y63D突变组的培养上清中不存在DNA病*颗粒和（核）裸衣壳。然而，通过使用HBV正链（+）特异性探针杂交，在Y63D转染细胞的培养上清中检测到内含RNA的病*样颗粒和（核）裸衣壳（图1B），灰度密度分析表明Y63D突变组正链探针杂交信号较wt组稍强。该结果表明HBVRNA能够在病*DNA合成之前以病*样颗粒和裸衣壳形式释放，并在病*逆转录被阻断时释放增强。
图1.细胞培养上清中存在HBVRNA病*样颗粒
使用逆转录酶抑制剂拉米夫定（3TC）抑制HBVDNA复制的实验组进一步支持了上述观点。如图2所示，在HepAD38细胞中诱导HBV表达后，3TC处理完全抑制了病*核心DNA的合成和含DNA颗粒的产生，导致细胞内含pgRNA颗粒的积累。值得注意的是，3TC处理的HepAD38细胞释放含HBVRNA的VLP和裸衣壳的时间依赖性与未处理细胞产生病*颗粒的动力学相似。结果进一步证明上清HBVRNA与VLP和裸衣壳相关，并且逆转录抑制剂阻断细胞内病*DNA复制，能够提高病*RNA颗粒的水平。
图2.3TC处理HepAD38细胞培养上清中存在HBVRNA-VLP
HBVRNA-VLP的产生需要pgRNA衣壳化
考虑到HBVRNA-VLP出现的位置与凝胶电泳中的DNA病*颗粒位置一致，作者推测RNA-VLP含有HBV衣壳。为了验证这一假设，作者在使用衣壳装配调节剂(CpAM)AT-61、SBA-R01或GLS-4处理的细胞中评估了wtHBV和Y63D突变体的病*颗粒分泌能力。GLS-4是一种1类（class-I）CpAM，可诱导非衣壳HBVcore蛋白聚合物的降解，AT-61和SBA-R01属于2类（class-II）CpAM，可诱导形成不含pgRNA的空衣壳。如图3A所示，AT-61和SBA-R01在wt和Y63D突变病*表达质粒转染细胞中均未影响HBVRNA转录或衣壳形成，但显著抑制pgRNA衣壳化。因此，在wtHBV转染的细胞中，细胞内HBV核心DNA、细胞外病*颗粒和裸衣壳的数量显著减少。更重要的是，2类CpAM显著抑制了Y63D突变体转染细胞产生含有HBVRNA的裸衣壳和VLP。此外，1类CpAMGLS4还能够通过阻断衣壳装配，进而抑制Y63D转染细胞中HBVRNA-VLP和RNA裸衣壳的释放(图3B)。以上结果提示，与HBVDNA病*颗粒一样，pgRNA衣壳化是HBVRNA-VLP产生的前提。
图3.HBVRNA-VLP产生需要pgRNA衣壳化
HBVRNA-VLP的产生需要包膜
为进一步探究RNA-VLP的分泌是否需要包膜，作者使用了四种HBV表达质粒，分别是pCMVHBV、pCMVHBVΔPol、pCMVHBV-Y63D和pCMVHBV-Y63DΔS，ΔPol突变体的P蛋白表达存在缺陷，无法形成含pgRNA衣壳，ΔS突变体阻断了三种乙肝病*包膜蛋白的表达。如图4所示，上述质粒单独转染Huh7细胞表现出类似的乙型肝炎病*RNA转录和core蛋白表达水平，ΔPol突变体转染细胞内不能检测到衣壳化pgRNA，Y63D和Y63DΔS突变体转染细胞均不能检测到病*衣壳化DNA。此外，wtHBV、Y63D和ΔPol突变体转染细胞的培养上清中能够检测到具包膜病*颗粒，Y63DΔS突变体转染细胞培养上清中没有检测到具包膜病*颗粒(图4B)。HBV正链特异性探针杂交时，与图3中的结果一致，检测到的杂交信号在wt和Y63D突变组的病*颗粒和裸衣壳中存在，在ΔPol突变组中不存在(图4B)。此外，阻断病*包膜蛋白表达的Y63DΔS突变组的病*样颗粒位置无RNA杂交信号，但突变没有影响RNA衣壳化，表明HBVRNA-VLP的分泌，类似于DNA病*颗粒，依赖病*包膜蛋白。因此，作者认为HBVRNA-VLP是一种具有包膜和衣壳化pgRNA的新型HBV病*颗粒。
图4.HBVRNA-VLP的产生需要病*包膜
HBVRNA病*颗粒利用MVB途径分泌
HBVDNA病*颗粒通过劫持细胞内吞体分选转运复合体（Endosomalsorting