摘要
在这项研究中，作者发现γ-H2AX（DNA双链断裂（DSBs）的标志物）和活化形式的磷酸化Chk2（p-Chk2）的水平在与HBV相关的肝细胞癌和邻近的再生结节中均显著升高。同样，将pHBV或pMyc-HBx质粒导入细胞会诱导γ-H2AX灶的积累并增加p-Chk2水平。在这些细胞中，Cdc25C磷酸酶（Ser（））和CDK1（Tyr（15））的抑制性磷酸化水平升高。因此，细胞周期进程在G2/M期被延迟。这一现象提示HBVX蛋白（HBx）激活ATM-Chk2途径可诱导细胞周期延迟。因此，用咖啡因或siRNA对共济失调毛细血管扩张突变基因（ATM）的抑制可消除了p-Chk2水平的增加，并恢复ChangX细胞中延迟的CDK1激酶活性。作者还发现，细胞质HBx而非核HBx诱导了活性氧（ROS）的产生，并导致γ-H2AX灶的积累和p-Chk2水平的升高。总之，这些数据表明HBx诱导的ROS积累导致DNA损伤，从而激活ATM-Chk2途径。作者的发现为HBV发病机理提供了新见解。
DNADSB发生在HBV
相关的肝细胞癌和再生结节中
DNA的双链断裂（DSB）是遗传不稳定性的主要原因。H2AX和Chk2都可由DSB诱导。在这项研究中，作者对HBV感染癌症患者石蜡包埋的HCC组织和邻近再生结节的标本用抗-γ-H2AX和抗-p-Chk2抗体进行了免疫组织化学检测，以评估两者的水平。结果显示，在十个正常肝脏组织中未观察到核染色阳性，但有40-60％的HCC患者的再生结节和肿瘤组织呈γ-H2AX和p-Chk2染色阳性（图1a，b），且随着疾病的进展，γ-H2AX和p-Chk2阳性细胞的比例增加（图1c）。这一结果提示，在乙肝病*感染的肝组织中DSB的形成是持续进行的（注：作者并未对炎症存在进行鉴定，无从知道炎症轻微的免疫耐受期是否存在DSB）。
图1.在HBV相关的肝细胞癌中DNA损伤信号增加。
HBx在细胞中的表达
增加了γ-H2AX阳性细胞的比例
HBx在HCC的发病机理中起着至关重要的作用。为明确肝组织中γ-H2AX的积累与HBx直接相关，作者首先对可诱导表达HBx蛋白的ChangX细胞进行γ-H2AX染色。这些细胞在连续传代过程中，撤DOX可检测到HBx蛋白。作者发现所检查的细胞中有一半γ-H2AX呈强阳性（图2a）。接下来，将HBx基因瞬时导入到Chang细胞中，发现48h后，有24.7％的HBx转染细胞出现代表DNA损伤的γ-H2AX阳性灶。接下来，作者在pHBV转染的细胞中证实了上述发现。将HBV基因组质粒（pHBV）转染到Chang细胞中，48小时后γ-H2AX染色的结果提示，在大约20％pHBV转染的细胞中发生了DNA损伤（图2b）。然而，当用HBx缺陷的HBV基因组转染细胞（PHBV-X-;HBx蛋白的翻译起始密码子被破坏），γ-H2AX阳性细胞的比例显著降低（22.6％对11.7％，**P0.01）。作者通过免疫印迹检测γ-H2AX的水平，证实了这些发现，表明pHBV以剂量依赖的方式提高了γ-H2AX的水平（图2c）。但是，即使没有HBx表达，仍然有γ-H2AX阳性细胞保留（图2b，c）。因此，在pHBV-X-?细胞中γ-H2AX阳性细胞可能来自HBV表面抗原（HBs）表达，因为最近报道HBs也可以诱导DNA损伤。总之，这些数据表明HBx是引起HBV相关肝细胞DSB的主要因素之一。
图2.HBx表达后，γ-H2AX阳性细胞增加。
HBx激活ATM–Chk2途径
会导致G2/M过渡期细胞周期延迟
ATM和ATR是响应不同类型DNA损伤的主要传感器激酶。它们激活Chk1和Chk2，磷酸化下游分子p53和Cdc25家族蛋白等。因为在表达HBx的细胞和人类肝脏组织中，代表DSB的γ-H2AX的水平增加，所以作者研究了HBx是否激活ATM–Chk2信号级联反应。众所周知，在DNA受损时，ATM会使Chk2的Thr68磷酸化，而ATR在停滞的复制叉处使Chk1的Ser磷酸化（Bartek＆Lukas，）。HBx表达48小时后p-Chk2水平升高，而p-Chk1水平保持不变（图3a）。为了验证这一过程中ATM是否为p-Chk2的上游激酶，作者将ATM或ATR的siRNA与HBx共转染。如图3b所示，HBX诱导的p-Chk2水平的升高被ATMsiRNA消除，但未被ATRsiRNA消除，这表明HBx诱导的p-Chk2水平升高是由ATM激活的。
此外，作者研究了HBx对ATM-Chk2途径的激活是否影响细胞周期进程。在G2/M转换时，CDK1蛋白Tyr15的去磷酸化激活其激酶活性，该反应由Cdc25C磷酸酶催化。DNA受损后，活化的Chk2使Cdc25C的Ser磷酸化，失去对CDK1的Tyr15去除磷酸的能力，从而抑制细胞周期进程。作者发现，表达HBx的细胞中Cdc25C（Ser）被磷酸化，表现为p-Cdc25C水平与p-Chk2水平一起增加（图3a）。此外，在HBx转染的细胞中CDK1的p-Tyr15水平仍然是升高的（即未被激活）（图3c，右图）。总之，这些数据表明，HBx激活ATM-Chk2途径会影响细胞周期进程。
作者进而用pMyc或pMyc-HBx转染了Chang细胞，并使用双胸苷阻断（DTB）方法将其同步在G1/S交界处。从DTB释放的时间定义为零时间（T?=0）。FACS分析结果（图3c）显示，从DTB释放8小时后，对照组和HBx转染组中的大多数细胞已进入G2/M期（83.99％vs78.78％）。12小时后，对照组中G2/M期的细胞百分比已显著降低（降至22.61％），但在HBx转染的细胞中仍保持较高水平（52.1％）。与之一致，ChangX细胞中CDK1活性在DTB释放后12小时达到峰值，相对于Chang细胞延迟了2小时。在ChangX细胞中，CDK2活性的恢复也被延迟。与CDK1和CDK2激酶活性一样，ChangX细胞中细胞周期蛋白A和B的降解被延迟（图3d）。作者推测，如果由HBx引起的细胞周期延迟是由ATM–Chk2途径引起的，则咖啡因对ATM的抑制作用将挽救这种细胞周期进程的延迟。作者发现ChangX细胞中CDK1激酶活性在DTB释放后12小时达到峰值，而添加咖啡因（作为ATM抑制剂）导致该峰更早地出现在9小时（图3e）。因为曾有报道HBx可诱导p38活化，而活化的p38激酶参与了DNA损伤反应。作者也设计了一组p38MAPK抑制剂SB的实验。与加入咖啡因组相比，添加SB不会改变ChangX细胞的细胞周期概况。综上所述，这些数据表明HBx激活了ATM-Chk2信号级联反应，从而导致了G2/M期的细胞周期延迟。
图3.HBx通过ATM-Chk2途径激活诱导G2/M延迟。
HBx增加细胞ROS水平，
这与DNA损伤反应的激活有关
接下来，作者研究了肝细胞中HBx蛋白诱导DNA损伤的机制。作者观察到，将pMyc-HBx转染到Chang细胞中会以时间依赖性方式增加细胞ROS的水平（图4a，左）。此外，ROS水平的升高伴随着p-Chk2水平的升高（图4a，右）。既往研究报导，HBx定位于细胞核、细胞质还是线粒体中取决于其表达水平，其亚细胞定位对其在致癌作用各个阶段的多效性作用很重要。因此，作者使用了HBx的两个不同亚细胞定位的突变体pHBx-NLS和pHBx-NES，它们分别编码在N末端包含核定位信号（NLS）或核输出信号（NES）的HBx。正如预期的那样，HBx-NLS仅位于细胞核中，而HBx-NES主要位于细胞质中（图4c）。值得注意的是，有24％的pHBx-NES转染的细胞中γ-H2AX免疫染色阳性。相比之下，只有8.5％的转染了pHBx-NLS转染的细胞γ-H2AX免疫染色呈阳性（图4c）。与此一致，pHBx-NES转染的细胞中p-Chk2水平高于用pHBx-NLS转染的细胞（图4c）。
图4.HBx诱导的DNA损伤与ROS的产生相关。
讨论
这项研究中，作者证明了HBx引起宿主基因组的双链断裂。为了应对这些DSB，宿主细胞通过激活ATM-Chk2检查点途径，从而延迟了细胞周期进程。此外，细胞质HBx(HBx-NES)可以诱导ROS和γ-H2AX灶的形成，而核HBx(HBx-NLS)则不能。因此，线粒体产生的ROS可能是肝细胞HBV相关DNA断裂的主要来源。
KimS,LeeHS,JiJH,ChoMY,YooYS,ParkYY,ChaHJ,LeeY,KimY,ChoH.HepatitisBvirusXproteinactivatestheATM-Chk2pathwayanddelayscellcycleprogression.JGenVirol.Aug;96(8):-.doi:10./vir.0..EpubApr14.PMID:.
文字：彭思雯
排版：阿卜杜
校对：李桂馨、郑立威
片警实验室
乙肝病*病原学及相关研究
pianjinglab
.年揭阳市消除艾滋病梅*和乙肝母婴传播项目业务培训班和揭阳市出生缺陷防控项目新生儿遗传代谢病筛查技术培训班于年12月26日在我市迎宾馆顺利举行。本次培训班由揭阳市卫生健康局主办、揭阳市妇幼保健计划生育服务中心承办。
出席培训班的领导和专家有揭阳市卫生健康局妇幼科王少峥科长、揭阳市妇幼保健计划生育服务中心院长刘建志、医院传染科主任钟少龙、梅州市新筛中心主任*烁丹和东莞市新筛中心主任叶立新等专家。
通过对消除艾滋病、梅*和乙肝母婴传播项目诊疗技术规范、实验室技术规范；对新生儿疾病筛查新要求、遗传代谢病筛查和诊疗进展、新生儿先天性肾上腺皮质增生症筛查和串联质谱筛查、新生儿静脉采血和血片制备技术等进行阐述和演示。
讲课专家
消除艾滋病梅*和乙肝母婴传播项目业务培训班和揭阳市出生缺陷防控项目新生儿遗传代谢病筛查技术培训班各有多人参加，会场气氛十分热烈，认真听讲，增强了对消除艾滋病梅*和乙肝母婴传播项目、新生儿遗传代谢病筛查工作的认识与责任感。消除艾滋病梅*和乙肝母婴传播项目要求艾滋病和乙肝母婴传播率2%,孕产妇产前检测率95%，孕产妇孕早“三病”检测率90%,感染“三病”孕产妇用药率95%，目前我市消除艾滋病、梅*和乙肝母婴传播工作仍需加大力度推进工作。
新生儿疾病筛查是提高出生人口质量，减少出生缺陷的三级预防措施之一。是《母婴保健法》、《母婴保健法实施办法》规定的母婴保健防控项目。新生儿遗传代谢性疾病筛查要达到95%以上的目标，目前我市新筛工作仍较滞后，通过这次培训，将有效推进我市新工作新的进展。
★识别